skip to Main Content

Tvivlen på DNA-spiralen

Bild: Gerd Altmann, Pixabay

I dag tycker vi att dna-spiralens dubbelhelixstruktur är självklar. Men när den först presenterades var tvivlarna många.

Det har gått 68 år sedan James Watson och Francis Crick publicerade det berömda förslaget till dna-struktur i tidskriften Nature i april 1953. Den föreslagna strukturen var till stor del resultatet av inspirerade gissningar baserade på knapphändiga röntgendata som tagits fram av andra. Få andra vetenskapliga prestationer under det senaste århundradet har analyserats i så stor detalj och återberättas så ofta.

Publiceringen rönte dock inte något större intresse. I en intervju i tidskriften Time år 2003 berättade James Watson att artikeln mottogs med nästan total tystnad.

Det var först på 1960-talet som andra forskare började referera till artikeln.

Hur kan det komma sig?

För de flesta av oss är dna-strukturen så självklar att vi tycker att det är nästan omöjligt att förstå att inte alla omedelbart föll för den. Anledningen var replikationsproblemet. Upplindningen och separationen av de två strängarna i dubbelhelixen var en nödvändighet i den modell av dna:s replikation som Watson och Crick föreslog i sin artikel i maj 1953. Varje dna-sträng i dubbelspiralen skulle sedan kopieras till en ny dubbelhelix med en komplementär sekvens av nukleotider.

I sin artikel hade Watson och Crick uttalat att upplindningsproblemet skulle lösas ”på något sätt”. Men hur kunde två nukleotidsträngar, som omger varandra tätt, brytas loss ifrån varandra?

Max Delbrück – obestridd ledare för den så kallade ”fag-gruppen” på Caltech och en av de mest respekterade molekylärbiologerna på 1950-talet – var en av dem som funderade över detta. Han uttryckte sin åsikt i ett brev till Watson: ”Svårigheterna med att linda upp kedjorna verkar, trots allt, oöverstigliga för mig.”

I en bok med titeln Meselson and Stahl and the replication of DNA av Frederic Lawrence Holmes dokumenteras i detalj korrespondensen mellan James Watson, Max Delbrück och flera viktiga aktörer inom det framväxande området molekylärbiologi.

Watson och Cricks dna-modell och dess replikation var under många år ett stående problem i diskussionerna inom det molekylärbiologiska forskarsamhället. Från redovisningarna i Holmes bok kan man inte bara läsa om de ovanstående invändningarna från Delbrück, utan också från många andra forskare. Delbrück var inte den enda skeptikern.

Robert Sinsheimer – blivande ordförande för Caltech’s Biology Department och en av initiativtagarna till The Human Genome Project – gav en föreläsning så sent som 1956 där han sade att ”bevisen som kopplar gener till dna är inte övertygande”. Vidare att det fanns ”inget experimentellt stöd för antagandet att genetisk information bärs av en nukleotidsekvens”.

Han ångrade förmodligen dessa ord några år senare.

I Frederic Lawrence Holmes bok från 2001 kan man också läsa om de tvivel som Watson själv hade om riktigheten i den föreslagna dna-strukturen. I brev till Max Delbrück uttryckte han detta.

Han oroade sig inte bara för bristen på högupplösta röntgendata, utan också för de så kallade ”Chargaff-förhållandena” – det vill säga kvoterna mellan nukleotiderna adenosin/ tymin (A/T) och cytosin/guanin (C/G). Enligt dna-modellen skulle de ha värdet 1,0 men i verkligheten var de uppmätta kvoterna osäkra. De experimentella värden för kvoten A/T varierade mellan 1,03 och 1,06. För C/G låg de mellan 0,85 och 0,93.

I själva verket var det först i början av 1960-talet som dessa förhållanden var i överensstämmelse med förutsägelserna i Watson och Cricks dna-modell.

Att bevisa eller motbevisa den föreslagna mekanismen för dna-replikering blev en återkommande angelägenhet inom molekylärbiologin i början och mitten av 1950-talet. Förslag på alternativa mekanismer lades fram. Men alla var inte bekymrade. Ett anmärkningsvärt undantag var den brittisk-sydafrikanske biologen Sydney Brenner. I början av 1950-talet var han kollega till Watson och Crick på det berömda MRC-laboratoriet i Cambridge i England. Ett av hans så kallade bon mots var: ”Om en teori förklarar något intressant, oroa dig inte så mycket för det som den inte förklarar.” Det vill säga: Om naturen har hittat på en så vacker struktur för dna, som den dubbelhelix som föreslagits av Watson och Crick, måste naturen också ha hittat på ett sätt att linda upp den.

Det experiment som slutligen avlägsnade det mesta motståndet mot den replikationsmodell som föreslagits av Watson och Crick genomfördes i slutet av 1957 av två unga doktorander vid Caltech, Matthew Meselson och Franklin Stahl. Frederic Lawrence Holmes bok behandlar i detalj de händelser som ledde fram till dessa experiment.

Matthew Meselsons intressen rörde främst fysikalisk kemi, Franklin Stahls experimentell cellbiologi. Båda träffade och pratade forskning med James Watson vid det marinbiologiska laboratoriet i Woods Hole år 1954. Meselson hade redan då en idé om hur man skulle kunna testa alternativa teorier om dna-replikering. Genom att införliva tunga isotoper i dna från en organism under dess tillväxt kunde man sedan på något sätt bestämma isotopinnehållet i dna med hjälp av ultracentrifugering.

Meselson diskuterade denna idé med Watson, som föreslog att detta experiment skulle provas på The Svedbergs laboratorium i Uppsala och inte på Caltech. En betydande del av den biologiska forskningen på Caltech var dock under dessa dagar kopplad till bakteriofager. Meselson var fascinerad av idén att man borde kunna separera fager i en ultracentrifug. De som odlas med vanlig uracil i ett medium kunde separeras från de som odlas i ett medium med den ”tyngre” analogen 5-bromuracil.

Två partier bakteriofager bereddes – en där fagerna förökats i uracil och en där de förökats i närvaro av 5-bromuracil. Vid experimenten med de två olika partierna fager sågs tydligt två väl separerade dna-band. Samtidigt arbetade Meselson med sin doktorsavhandling hos Linus Pauling. Den ursprungliga uppgift han hade fått var att lösa röntgenstrukturen för en amid. Efter sina ultracentrifugeringsexperiment fick han dock tillstånd att inkludera ännu ett kapitel i doktorsavhandlingen: ”Jämviktscentrifugering av makromolekyler i täthetsgradienter med tillämpningar på DNA-studier.”

Han försvarade sin avhandling den 23 maj 1957. Betygskommittén skulle troligen fått alla dåtidens unga fysikaliska kemister att skälva: Linus Pauling, Richard Feynman, Harden McConnell och Jerome Vinograd. Examinationen gick dock bra och Pauling blev imponerad av metoden för täthetsgradienter i ultracentrifuger.

När Meselson hade klarat av sin doktorsexamen kunde han åter ägna tid åt dna och replikationsproblemet. Han och Stahl övervägde nu ett nytt experiment för att kasta ljus över detta. Tanken var att använda dna från E. coli och odla bakterien i närvaro av 5-bromuracil, och sedan följa vad som hände med detta märkta dna efter en, två, tre och så vidare, celldelningar i ett medium med omärkt uracil.

Försöket misslyckades. Men en annan idé om isotopmärkning kunde nu bli verklighet. I augusti 1957 fick Meselson en idé när han bläddrade igenom en katalog från ”Isomet Co” – ett företag som sålde isotopanrikade kemikalier. Enligt katalogen kunde företaget nu leverera föreningar märkta med kväveisotopen 15N. Han beställde ammoniumklorid märkt med kväve-15 som anlände i september 1957.

Stahl visade att E. coli kunde växa bra med den märkta föreningen som enda kvävekälla. Kväve-15-märkt dna extraherades från bakterierna och utsattes för en täthetsgradientcentrifugering. Det kväve-15-märkta dna:t gav ett enda skarpt band. I oktober genomfördes en andra täthetsgradientkörning på en blandning av dna odlat i E. coli med användning av vanlig ammoniumklorid och dna från E. coli odlad på kväve-15-märkt ammoniumklorid. Två väl separerade, skarpa band erhölls.

Det verkade nu genomförbart att observera band från dna med mellanliggande isotopinnehåll.

I slutet av oktober inleddes det avgörande märkningsförsöket. E. coli odlades med kväve-15-märkt ammoniumklorid i mediet under 14 timmar. Kväveatomerna i dess dna borde nu enbart vara isotopen kväve-15. Därefter tillsattes ett tiofaldigt överskott av vanlig ammoniumklorid till odlingen. Omedelbart efteråt togs ett prov av bakteriemassan, som direkt kyldes och lyserades för att få fram dess dna. Ytterligare prover togs med 15 minuters intervall, kyldes, lyserades och lagrades.

Täthetsgradientcentrifugering utfördes på vart och ett av de lagrade proverna. I det första sågs bara ett ”tungt” dna-band. I följande prover dök gradvis ett andra halvtungt band upp medan det ”tunga” bandet gradvis försvann. Efter två till tre generationer började ett nytt helt ”lätt” dna-band att dyka upp medan det ”halvtunga” bandet gradvis helt försvann. Allt fungerade som förväntat. Meselson skrev snabbt ett brev till Jim Watson om det nya lyckade experimentet och slutade med en vers med texten: ”Now 15N by heavy trickery, ends the sway of Watson Crickery!

I mars 1958 skrev Matthew Meselson och Franklin Stahl slutligen en artikel avsedd för Proceedings of the National Academy of Sciences där alla deras experiment redovisades.

Effekterna av publikationen var betydande. Nu nådde märkningsförsöken och deras tolkning utanför den sammansvetsade gruppen molekylärbiologer. Uppsatsen var försiktigt och omsorgsfullt formulerad och dna-bandens natur bekräftades inte uttryckligen. Men i ett diskussionsunderlag förberett för ett ”Cold Spring Harbour Symposium” i juni 1958 med titeln ”Utbyte av genetiskt material: Mekanismer och konsekvenser” presenterade Meselson och Stahl sin strategi och dess tolkning klart och tydligt. Experimentet beskrivs nu som ett ”direkt test av Watson– Cricks hypotes”.

För vissa forskare var detaljerna om upplindningsprocessen fortfarande oförklarliga. Invändningarna avtog långsamt men fortsatte in på det tidiga 1960-talet.

I ett elegant experiment år 1961 använde engelsmannen John Cairns autografi av tritiummärkt T2-fagdna för att visa att detta hade en längd på 50 μ – en siffra som utmärkt överensstämmer med att dna-molekylen var en enda dubbelspiral. Senare visade Cairns övertygande, återigen med autoradiografi men nu på tritiummärkt ”lambda fag” dna, att replikationen av dna innebar en separation av polynukleotidsträngarna. Watson–Crick-modellen måste därmed vara korrekt.

Dessa experiment verkar ha övertygat även de mest skeptiska och den semikonservativa replikationsmodellen blev till slut allmänt accepterad.

Nobelpriset i fysiologi eller medicin år 1962 tilldelades Crick, Watson och Wilkins ”för deras upptäckt av nukleinsyrornas molekylära uppbyggnad och dess betydelse för informationsöverföring i levande materia”.

Vi vet i dag att inte bara Karolinska institutets Nobelkommitté, utan även Nobelkommittén i kemi hade fått nomineringsförslag rörande dna-strukturen. Enligt Nobelarkivet kom de första år 1960 – då en nominering kemi och två i medicin eller fysiologi. Under 1961 kom ingen nominering till kemipris men tre till medicin eller fysiologi. Prisåret 1962 kom sex nomineringar i kemi och fem till medicin eller fysiologi.

Hade det kunnat bli ett Nobelpris i kemi 1962? Jag har ingen tillförlitlig information om hur diskussionerna gick inom Kemikommittén vid denna tid. Men betänk vilka kemipris som utdelades 1962 – Max Perutz och John Kendrew, bland annat för deras studier av strukturen hos hemoglobin och myoglobin – och 1964 – Dorothy Crowfoot Hodgkin, bland annat för röntgenstudier av penicillin och vitamin B12. Båda dessa pris belönade milstolpar inom strukturbiologin. Detta sällskap kunde kanske de lågupplösta diffraktionsmätningarna på dna-fibrer inte mäta sig mot, även om de låg till grund för en länge omstridd men revolutionerande dna-struktur.

I rest my case.

Text: Sture Forsén, professor emeritus vid LTH och initiativtagare till tvärvetenskapliga Pufendorfinstitutet vid Lunds universitet. Han var medlem i Nobelkommittén för kemi 1976–1995.

Denna artikel publicerades första gången i Kemisk Tidskrift nr 2 2020.